Ciljevi, ideja i značaj

Glavni cilj predloženog projekta BioProCro je sveobuhvatna procjena potencijalne toksičnosti prirodnih spojeva uz pomoć brojnih toksikoloških biotestova kojima će se testirati učinci na različitim razinama biološke organizacije. Ideja ovog projekta je unaprijediti postojeće biomarkere uz pomoć kojih će, zbog njihove izrazite osjetljivosti na toksikante, biti uspostavljeni testovi u svrhu testiranja širokog spektra potencijalno toksičnih spojeva. Značaj projekta odrazit će se u odabiru, za zdravlje i okoliš,  sigurnih prirodnih spojeva, koji će imaju potencijal u farmaceutskoj, kozmetičkoj i prehrambenoj industriji.

Znanstvena osnova

Projektni prijedlog nastao je kao odgovor na rastuću svijest o potencijalnoj toksičnosti prirodnih spojeva. Identifikacija spojeva koji uzrokuju mutacije te DNA i kromosomska oštećenja ključna su u procjeni sigurnosti, s obzirom da mutageni spojevi izravno mogu oštetiti stanice te uzrokovati nastanak karcinoma. Potencijal nekog spoja da uzrokuje genske mutacije odredit će se uz pomoć izrazito osjetljivih i standariziranih in vitro testova uspostavljenim na bakterijama. Istovremeno, genskom ekspresijom utvrdit ćemo potencijalno štetan utjecaj prirodnog spoja na molekularnoj razini. In vivo testovi provodit će se na dva modelna organizma – a) gujavici (Eisenia fetida, Savigny 1826, i b) zebrici (Danio rerio, Hamilton- Buchanan, 1822)

  1. fetida, kao epigejna vrsta gujavica često se koristi u ekotoksikološkim istraživanjima. Karakterizira ju visoka reproduktivna stopa, kratak životni ciklus, jednostavnost održavanja unutar laboratorija te izrazita osjetljivost na široki raspon toksikanata. Zbog navedenih razloga, na vrsti E. fetida uspostavljeno je nekoliko standardiziranih testova toksičnosti (OECD 1984, 2004; ISO 1993, 1998), prema kojima je preporučena kao jedan od najboljih modelnih organizama za procjenu štetnog utjecaja toksičnih spojeva na kopnene ekosustave.
  2. Zebrice vrste Danio rerio posjeduju visok stupanj homolognosti sa ljudskim genomom, što je do danas rezultiralo velikim napretkom u područjima razvojne i stanične biologije, genetike, onkologije, embriologije, teratologije, neurobiologije, znanosti o okolišu, regenerativne medicine te evolucije. Zbog kratkog reproduktivnog ciklusa, jednostavnog održavanja, jeftinih i bržih testova u odnosu na testove uspostavljene na štakorima/miševima, zebrice su vrlo pogodne za istraživanja bioaktivnih spojeva. Toksikološke studije na zebricama mogu uključivati sve životne stadije (od embrija do odrasle jedinke).

U procjeni toksičnosti bioaktivnih spojeva predlažemo nekoliko biomarkera/bioloških testova. Mehanizam multiksenobiotičke otpornosti (posredovan aktivnošću ABC transportnih proteina) ima temeljnu ulogu u transportu egzogenih i endogenih spojeva preko staničnih membrana, te na taj način predstavlja

″prvu liniju obrane″ organizma od štetnih spojeva prisutnu u svim živim bićima. Mnogi spojevi (prirodni ili ksenobiotici) mogu inducirati/inhibirati MXR transportnu aktivnost, što može uzrokovati povećanu osjetljivost stanica na toksične spojeve (kemosenzitizacija) te njihovu akumulaciju u cijelom organizmu, što u konačnici može rezultirati štetnim fiziološkim/patološkim oštećenjima.

Štetan utjecaj bioloških spojeva može se procijeniti i pomoću određivanja biokemijskih profila tkiva, uključujući ispitivanje oksidativnog stresa kao pokazatelja funkcionalnog statusa organizma. Iako ne postoji jedinstvena metodologija i uspostavljene granične vrijednosti enzima, metabolita i elektrolita kod zebrica, mjerenje tih parametara može biti pokazatelj fizioloških poremećaja u ribe izložene ispitivanim spojevima. Također, mjerenje genske ekspresije citokina omogućit će nam praćenje imunološkog odgovora zebrice izložene testiranim spojevima te će biti od koristi u procjeni mogućeg imunotoksičnog potencijala testiranih bioloških spojeva.

Fiziološke/patološke promjene na višoj razini biološke organizacije mogu biti otkrivene uz pomoć histoloških analiza struktureorgana i tkiva. Razina oštećenja stanice i tkiva (apoptoza, atrofija, nekroza) dat će nam uvid u toksični potencijal ispitivanog spoja. Ovi rezultati od velike su važnosti s obzirom na veliki nedostatak znanstvenih informacija vezanim uz patohistološke promjename zebrica nakon izlaganja toksikantima. Upravo iz navedenih ciljeva, namjeravamo razviti i unaprijediti pouzdane biotestove / biomarkere za učinkovitu procjenu potencijalne toksičnosti.

Kompetencije istraživačke skupine

Za provedbu tematskih aktivnosti MOBA (Modelni organizmi u biotehnološkoj aplikaciji) platforme biti će uključena istraživačka grupa Rozelindre Čož-Rakovac (Laboratorij za ihtiopatologiju-biološke materijale, Instituta Ruđer Bošković) Provedbenu skupinu čini niz stručnjaka iz različitih znanstvenih područja (veterina, molekularna biologija, ekologija, toksikologija, biotehnologija) kompetentnih za procjenu potencijalne toksičnosti. Odlikuje ih veliko dosadašnje iskustvo u radu sa bakterijama, vodenim i kopnenim modelnim organizmima, kao i kulturama stanica koristeći najnovije medote iz područja biokemije, genetike, citogenetike, mikrobiologije, enzimologije, toksikologije i bioinformatike.

Ekspertize koje će se implementirati kao dio projektnog prijedloga su sljedeće:

  • procjena genotoksičnosti bioaktivnog spoja uz pomoć eksperimentalnih modela kroz AMES test (na bakterijskim sojevima vrste Salmonella typhimurium) i kulture stanica (MN/ENA, Komet test)
  • procjena toksičnog i teratogenog potencijala testiranog spoja (test akutne embriotoksičnosti na zebricama)
  • određivanje mehanizma multiksenobiotičke otpornosti (MXR) – otkrivanje MXR inhibitora uz pomoć vodenih i kopnenih modelnih organizama (zebrice, gujavice)
  • procjena tkivnog   biokemijskog   profila   i   oksidativnog/antioksidativnog   statusa   kao       indikatora

(pato)fizioloških promjena (određivanje tkivnih parametara sa analizom podataka na temelju strojnog učenja) i procjena morfoloških promjena ciljanih tkiva (histološkim i histokemijskim metodama)

  • procjena učinka novih bioaktivnih spojeva na imunološki sustav zebrice (promjena parametara nespecifičnog imunološkog sustava)
  • procjena antimikrobnog potencijala bioaktivnih spojeva

Metode i njihova povezanost s određenim ciljevima

Ames test (ISO 16240: 2005) – Ames test (na spojevima bakterije Salmonella typhimurium) preporučuju regulatorne agencije u svrhu određivanju spojeva koji imaju humani i životinjski mutageni i/ili kancerogeni potencijal. U prvom koraku testiranja prirodnih spojeva provest će se procjena mutagenosti Ames testom pomoću dva Salmonella soja: TA 98 i TA 100. Mutageni potencijal odredit će se (za korišteni bakterijski soj i pripadajuću S9 frakciju), usporedbom broja kolonija mutanata s negativnom kontrolom i testnim uzorkom. Test mehanizma multiksenobiotičke otpornosti (mxr) – Nakon pred-tretmana (testni uzorak) i tretmana (mješavina testnog uzorka i fluorescentnog supstrata rodamina B) uslijedit će određivanje MXR inhibitornog potencijala testiranog bioaktivnog spoja u zebrici i gujavici.

Test embriotoksičnosti (ISO 15088: 2007) Toksični i teratogeni potencijal biti će određen uslijed izlaganja embrija zebrice testnom spoju u periodu od 24 i 48 h. Tijekom eksperimenta toksični i teratogeni potencijal utvrdit ćemo praćenjem letalnih (koagulacija embrija, nedostatak otkucaja srca, nedostatak somita, ne odvajanje repa) i sub-letalnih (zaostalost u razvoju, nedostatak pigmentacije, formiranje edema, deformacije kralježnice itd) učinaka.

Histopatološke analize – Jedinke gujavica i zebrica (embriji i odrasli) biti će podvrgnuti histopatološkim analizama koje uključuju fiksaciju tkiva, dehidraciju u rastućim koncentracijama alkohola i ksilenu, bojanje hematoksilinom i eozinom, te u konačnici mikroskopiranje u svrhu vizualizacije patoloških oštećenja tkiva. Komet test – Komet test je vrlo osjetljiva metoda za određivanje razine oštećenja i popravka DNA. Provodi se na predmetnom stakalcu u tankom sloju agaroznog gela, u kojem je suspendiran mali broj stanica koje se liziraju, prolaze elektroforezu te se u konačnici bojaju fluorescentnom DNA-interkalirajućom bojom. Razina oštećenja DNA određuje se pomoću nastalog “repa”, njegove duljine i intenziteta te repnog mometna kometa. Ovaj test nalazi primjenu u brojnim genotoksičnim ispitivanjima kemikalija i lijekova te biomonitoringu okolišta, a pokazao je i izrazitu osjetljivost tijekom određivanja oštećenja DNA u riba izloženih raznim ksenobioticima putem vodenog okoliša. U svrhu ispitivanja bioaktivnih spojeva, komet test će se ispitivati na stanicama pluća, grkljana i mjehura staničnih linija. Temeljem različitih staničnih  odgovora nakon izlaganja testnim spojevima, biti će moguće predložiti ovaj mehanizam kao osnovu u ispitivanju sigurnosti određenih spojeva.

RT-PCR – Nakon izolacije DNA uslijedit će kvantitativna analiza PCR-om unutar termalnog cikličkog uređaja koji usvjetljavanjem pojedinog uzorka zrakom svjetlosti određene valne duljine ima mogućnost detektiranja emisije fluorescence. Dobiveni rezultati ukazat će na ekspresiju PgP-a (P-glikoproteina) i MRP- a (engl. multidrug resistance protein) odabranog modelnog organizma u ovisnosti o toksičnosti ispitivanog uzorka.

MN/ENA test – in vivo test za genotoksično ispitivanje na temelju citogenetske procjene. Promjene u morfologiji jezgara eritrocita dobar su pokazatelj izloženosti genotoksičnim spojevima. Ovaj test primijenit će se na odraslim zebricama preko vodenog medija i inerperitonealno, kao jedan od pokazatelja potencijalne toksičnosti testiranih spojeva.

Oksidativni stres/Antioksidativni status – U svrhu provedbe jednog od najviše korištenih testova diljem svijeta, mjerit ćemo krajnji proizvod lipidne peroksidacije. Plazma lipidna peroksidacija odredit će se temeljem reaktivnih supstanci sa tiobarbiturnom kiselinom te uz pomoću markera antioksidativnog statusa eritrocita, odnosno Cu/Zn superoksid dismutaze, glutation peroksidaze, glutation i plazmatske razine vitamina C i E, malondialdehida, superoksid dismutaze i katalaze. Neki od parametara oksidativnog stresa/antioksidativnog statusa odredit će se in vitro na ljudskim stanicama.

Kirby-Bauer metoda difuzije antimikrobnih spojeva – sa svrhom praćenja antimikrobne aktivnosti bioaktivnog spoja provest će se metoda difuzije na agaru. In vitro antibakterijska aktivnost ispitivat će se na nekoliko bakterijskih sojeva primjenom difuzije na agaru (Kirby-Bauer analiza), u kojem će antimikrobi sadržani u ispitivanom spoju moći difundirati u mediju i ujtecati na svježe nacjepljen komponente. Da bi se utvrdio potencijalno negativan utjecaj prirodnog spoja na gujavicu E. fetida, jedinke će biti izlagane testnom spoju preko filter papir standardizirane metode.

Očekivani ishodi i njihovi potencijalni korisnici

Projekt će se provoditi toksikološka metodologiju i dopuniti ju s inovativnim pristupom u cilju procjene potencijalne toksičnosti prirodnih spojeva, što će rezultirati novim saznanjima o potencijalno štetnom učinku na različite razine biološke organizacije. Provedba ovog projekta predstavljat će značajno poboljšanje kapaciteta vezanih za komercijalizaciju aktivnosti i transfer tehnologije ka industriji. Ovaj projekt služit će kao poveznica interdisciplinarnog rada brojnih znanstvenika i industrije kojoj je potrebna znanstvena podrška.