Rezultati

Postignuti rezultati u prikazu prema projektnom prijedlogu i spomenutim kriterijima vrednovanja: 

  • Pripremljen je natječaj i provedena je nabava za odabir ronilaca za znanstveni probir bioloških materijala iz Jadranskog mora
  • Provedeno je uređenje i prilagodba prostora za smještaj novonabavljene opreme
  • Pripremljeni su natječaji i provedena je nabava i instalacija opreme u vrijednosti 6,667.160,00 kn+PDV ( 8,346.450,00), te obuka korisnika za rad na opremi (za IRB i sve partnere)
  • Provedeni su natječaji i zaposleno je 22 stručnjaka (10 doktorandi, 10 poslijedoktorandi i 2 administratora)
  • Ishođen je dio dozvola za sigurnosni pristup morskim resursima i zaštićenim vrstama morskih organizama od interesa
  • Obavljeno je 5 znanstvenih probira bioloških materijala (morski organizmi, sediment) za koja je zadužen stručnjak ronilac – biolog, taksonom. Uzorkovani su:  žarnjaci Eunicella cavolini, spužve Chondrosia reniformis; mahovnjaci Schizoporella errat, plaštenjaci Aplydium conicum, Phallusia mammillata; zelene alge Codium bursa, Caulerpa  cylindracea (staro ime Caulerpa racemosa var. Cylindracea), Dasycladus vermicularis; smeđe alge Cystoseira barbata, Scytosiphon lomentaria, Cutleria multifida, Taonia atomaria, Padina pavonica, Colpomenia sinuosa, Dictyopteris polypodioides, Halopteris filicina, Dictyota fasciola, alga na kamenu (nekad rod Dilophus), Fucus virsoide, crvene alge Amphiroa rigida, cijanobakterije Calothrix ili Rivularia sp., sa slijedećih lokacija: Zadar Kolovare, otok Iški Mrtenjak, Potkop Dragove (Dugi otok), Ljubačka vrata (Rtina), Paška vrata (Rtina), otok. Vis (luka Vis), Šepurine (kod Zadra), otok Galešnjak (kod Turnja), Rt Rtina, Svjetionik na otoku  Galešnjak.
  • Razvijeni su eksperimentalni protokoli za ekstrakciju, izolaciju, pročišćavanje i obogaćivanje morskih biomolekula i biomaterijala, uvele su se sofisticirane analitičke metode razvijanja znanja o načinu djelovanja ciljnih aktivnih molekula; procijenjena je djelotvornost i primjenjivost ekstrahiranih morskih biomolekula i biomaterijala za moguću primjenu u prehrambenoj, kozmetičkoj i farmaceutskoj industriji; optimizirani su postupci  i testirane metode unaprjeđenja i poboljšanja nekoliko novih sustava u kultiviranju mikroalgi, morskih vrsta bakterija, te se radi na  prevladavanju  “uskih grla” u održivim kulturama, i optimiziranju scale-up iz laboratorija u pilot-skali do procesa industrijskih razmjera za 7 faza projekta:  a) Biološka i kemijska raznolikost; b) Identifikacija, ekstrakcija, optimizacija i purifikacija biomolekula; c) Karakterizacija i način djelovanja bioaktivnih spojeva; d) Bioorganska sinteza; e)Testiranje na modelnim organizmima; f) Bioinformatika; g) Održivi bioprocesi za proizvodnju bioaktivnih supstanci i povećanje njihovog mjerila.
  • Dobiveno je nekoliko različitih vrsta projekata financiranih iz EU i iz državnog proračuna (prilog 3)
  • Uspostavljena je sinergija i suradnja između javnih i privatnih istraživačkih institucija i biotehnoloških tvrtki
  • Provode se aktivnosti osiguravanja dodatnih sredstava iz različitih fondova zaprovođenje opsežnih istraživanja
  • Organizirane su radionice i formalni/neformalni skupovi gdje su znanstvenici mogli razmijeniti svoja istraživačka iskustva vezana uz kapacitete hrvatskog podmorja
  • U tijeku je osmišljavanje strategije upravljanja znanjem i tehnologijama razvijenim tijekom projekta te njihova primjena u industriji, kako bi se postigao maksimalan učinak za ekonomiju i društvo EU.

Znanstveni rezultati

1. Biološka i kemijska raznolikost
Biološka raznolikost morskih staništa

  • Izronjeni organizmi su taksonomski okarakterizirani prema svojim morfološkim obilježjima te je provedena izolacija DNA i njihova pohrana
  • Provedena je kultivacija morskih mikroorganizama na selektivnim hranjivim podlogama, praćenje rasta pri različitim temperaturama i uz specifične inhibitore rasta; ispitane su morfološke i fenotipske karakteristike dominantnih bakterijskih vrsta; istražena je efikasnost primjene metode spektrometrije masa (MALDI-TOF MS) u identifikaciji uzgojenih mikroorganizama.
  • Na modelnim streptomicetima (S. rimosus i coelicolor te alkalofilnoj bakteriji roda Streptomyces sp.) uspostavljeni su protokoli za detekciju sinteze bioaktivnih spojeva koji inhibiraju rast modelnih gram-pozitivnih ili gram-negativnih bakterija te kliničkih patogenih sojeva (klasa ESKAPE).

Kemijska raznolikost morskih organizama

  • Testirana je metoda analize vršnih para odabranih smeđih i zelenih morskih algi (engl. headspace solid-phase microextraction) (bez zagrijavanja) na vlaknima različite polarnosti što je ključno za utvrđivanje relevantnih kemijskih profila.
  • Identificirani su terpeni (monoterpeni i sekviterpeni)- plinskom kromatografijom i spektrometrijom masa (GC-MS), koji imaju važnu ulogu u kemijskoj komunikaciji, velika koncentracija dimetil-sulfida u pojedinim algama vjerojatno doprinosi ciklusu kruženja sumpora u prirodi.
  • Razvijene su metode GC-MS analize ekstrakata dobivenih superkritičnom ekstrakcijom s CO2 (SC-CO2) različitih bioloških uzoraka (biljni materijali) kao i ultrazvučnom ekstrakcijom (USE) s otapalima različite polarnosti, kako bi se prilagodile za analizu morskih organizama i pratile komponente.
  • Razvijena je nova metoda dehidracija homogene tekuće-tekuće ekstrakcije koja bi se mogla koristiti za određivanje organskih spojeva otopljenih ili emulgiranih u morskoj vodi.

2. Istraživanja koja su vezana za identifikaciju, ekstrakciju, optimizaciju i purifikaciju biomolekula

  • Provedeno je optimiziranje postupaka izolacije bioaktivnih molekula (npr. karotenoidi, klorofili, polifenoli, masne kiseline) iz selektiranih organizama primjenom konvencionalnih i novih tehnika ekstrakcije.
  • Dobiveni su ekstrakti koji sadrže komponente različite polarnosti te je utvrđeno koja metoda je najpogodnija za izolaciju određene skupine biomolekula te kojom se metodom dobivaju veći prinosi.
  • Optimiran je postupak ekstrakcije različitim otapalima (voda, etanol, metanol, dimetil sulfoksid (DMSO) i heksan pri povišenom tlaku (PLE), ultrazvučne ekstrakcije (UAE), s ciljem dobivanja visokog udjela pigmenata (karotenoida i klorofila).
  • Pomoću plinske kromatografije s plameno ionizacijskim detektorom (engl. gas chromatography with flame ionization detector (GC-FID) utvrđen je profil masnih kiselina morskih organizama, dok je udio masti određen metodom prema Soxhletu.

3. Karakterizacija i način djelovanja bioaktivnih spojeva

  • Ekstrakt iz žarnjaka pokazao je najsnažniji citotoksičan učinak na fibroblaste te antiproliferativni učinak na tumorske stanice. Stoga je u tijeku frakcioniranje i razvoj protokola za identifikaciju metabolita MS metodom.
  • Razvijeni su protokoli za: evaluaciju mitohondrijske toksičnosti i nefrotoksičnosti biološki aktivnih spojeva u uvjetima in vitro, analizu lipida uz pomoć masene spektrometrije, proteomsko i molekularno profiliranje (fingerprinting) bioloških uzoraka
  • Razvijeni su novi koncepti i metodologije: Label-free proteomsko profiliranje bioloških uzoraka na platformi Synapt G2; vemurafenib-kemorezistentne stanične linije karcinoma kolona; analiza staničnog metabolizma na platformi Seahorse; razvoj koncepta kombinirane kemoterapije tumora inhibicijom signalizacije koja se odvija putem sfingozin kinaze.
  • Obavljen je dio analiza proteina (proteoma) iz morskih organizama i analiza uz pomoć 2D elektroforeze u kombinaciji s masenom spektrometrijom (MALDI-TOF MS) pokazalo se kako je glavni dio optimizacije protokola bila adekvatna liza čvrstog karbonatnog tkiva organizama. U tijeku je identifikacija razdvojenih proteinskih točaka i traka uz pomoć MALDI-TOF MS.

4. Bioorganska sinteza

  • Iz analiziranih uzoraka izronjenih morskih organizama prisutnost nepoznatih spojeva pokazuju: Acanthella cannabina (djelomčno nepoznati spojevi), Scopalina lyphyropoda (potpuno nepoznati kemijski profil), Suberite domuncula (djelomično poznati spojevi, ali nepoznati peptidi zanimljivi za daljnja istraživanja), Dictyonella incisa (veliki broj novih nepoznatih spojeva), Tethya aurentium (djelomično poznati spojevi, ali detektirane su skupine različitih novih funkcionalnosti). U tijeku je identifikacija nepoznatih spojeva, a za već okarakterizirane spojeve razmatraju se metode njihove retrosinteze.
  • Pripravljeni su leucetamini B i C, sekundarni metaboliti iz morske spužve, transformacijom beta-laktamskih prekursora. Istraživanja na području kemije beta-laktama proširena su i na pripravu kiralnih hidantoina, biološki aktivnih molekula nađenih u morskim organizmima. Iz započetih istraživanja očekuje se priprava strukturno različitih biološki aktivnih hidantoina s različitim biološkim odgovorom koje je potrebno ispitati na staničnim modelima. U okviru sinteze beta-laktama, pripravljeno je i okarakterizirano 6 novih struktura, te 15 iz njih izvedenih različitih urea. Svi okarakterizirani novi spojevi biti će testirani na biološku aktivnost.
  • Započeta su istraživanja na području sinteze novootkrivenih molekula iz gram-negativnih morskih bakterija, marinoaziridina A i B. U tijeku je sinteza marinoaziridina i njihovih derivata uz određivanje apsolutne konfiguracije novosintetiziranih molekula koja je do sada nepoznata, kao i njihova biološka aktivnost.
  • U tijeku su istraživanja na primjeni novih enzima iz grupe halohidrin dehalogenaza u organskim reakcijama. Na području enzimske primjene halohidrin dehalogenaza došlo se do rezultata u smislu sinteze enantiomerno obogaćenih fluoriranih kiralnih građevnih blokova visoke optičke čistoće.
  • Primjena eutektičkih otapala u asimetričnoj redukciji derivata acetofenona dovela je do novi spoznaja s obzirom na pionirsku primjenu takvih reakcijskih uvjeta redukcije uz stanice kvasca.
  • Primjenjena je metodologija organske sinteze u pripravi novih molekula koje pokazuju svojstva tekućih kristala.

5. Testiranje na modelnim organizmima/evaluacija biološke aktivnosti /potencijala

  • Testiranja su obavljena na ekstraktima Eunicella cavolini, Chondrosia reniformis, Aplydium conicum, Cystoseira barbata u dva različita otapala: voda i DMSO
  • Procjena mutagenog potencijala (AMES test) 49 nerazrijeđenih uzoraka na dva bakterijska soja Salmonella typhimurium, pokazala je da na 26 testiranih uzoraka nema mutagenog/genotoksičnog potencijala.
  • Test embriotoksičnosti (na embrijima zebrice Danio rerio) proveden je na tri ekstrakta Chondrosia reniformis (SWE, UAE, CAP) u tri razrjeđenja zbog prilagodbe protokola(koncentracija otapala unutar uzorka, mutnoća uzorka, pH, obojanost uzorka, itd).
  • Razvijena je metoda za kvantitativno određivanje histopatoloških promjena na embrijima zebrica.
  • Procjena antimikrobnog potencijala ekstrakata provedena je prema CLSI smjernicama na sojevima typhimurium TA1537, E.coli NCTC 12241 i P. aeruginosa NCTC 12469. Učinjeno je 75 testova antibakterijskog potencijala od kojih su neki pokazali prisutnost slabije ili jače izražene inhibicije bakterijskog rasta u ekstraktima otopljenim u vodi te ekstraktima otopljenim u DMSO-u.
  • Test antifungalnog potencijala proveden je na vrstama Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus flavus, Aspergillus ochraceus, Fusarium graminearum, Fusarium verticilioides, Penicillium expansum.
  • Optimizirani su abiotski čimbenici za uzgoj mikroalgi Dunaliella tertiolecta i Chlorella vulgaris na podlogama obogaćenim natrijevim selenitom i nanočesticama selena (SeNP) u svrhu povećanja udjela neutralnih lipida u stanici. Različite koncentracije SeNP pokazale su da je najveća akumulacija lipida dobivena u kultivaciji sa 10 mg/L SeNP što povezujemo s oksidativnim stresom, te pokazuje da su učinkoviti induktor proizvodnje lipida. Praćena je inhibicija rasta mikroalgi, koncentracija klorofila, ukupnih proteina, ukupnih lipida, udio zasićenih i nezasićenih masnih kiselina te sastav masnih kiselina, a u tijeku je i analiza aminokiselinskog sastava.
  • Utvrđen je pozitivni antioksidativni kapacitet (elektrokemijskim metodama voltametrije imobiliziranih mikrofilma i kapi te spektrofotometrijski) na mikroalgama praćenjem ukupnih antioksidansa i polifenola.

6. Bioinformatika

  • Razvijeni su modeli i mehanizmi kojima se može pratiti metabolizam bioaktivnih spojeva u živim organizmima i procijeniti njihova aktivnost na temelju metabolita koji nastanu od početnih spojeva u probavilu živih organizama. Provođena su istraživanja s ciljem razvoja novih algoritama za izbor reprezentativnoga skupa proteina male zalihosti (sličnosti) u primarnoj strukturi, a koji se koriste u razvoju novih metoda za modeliranje strukturnih svojstava i aktivnosti proteina
  • Razvijena je računalna platforma za anotaciju genomskih i metagenomskih sekvencija i pretragu korištenjem metoda obrade govornog jezika («natural language processing») – MEGGASENSE.
  • Određen je biopotencijal mikrobnih zajednica morskih sedimenata za razgradnju ugljikovodičnih spojeva kao posljedica zagađenja naftom i naftnim derivatima.
  • U nastavku istraživanja na funkcionalnoj anotaciji gena prokariotskih organizama rađeno je na dvije potpuno nove reprezentacije, potencijalno visoke i komplementarne prediktivne moći: metagenomskih podataka iz različitih okoliša i funkcionalnog susjedstva gena u genomu.
  • Testirane su generičke računalne procedure (“workflows”) za HT-QSAR: alati za generiranje deskriptora kemijskih spojeva i ciljanih molekula (proteina), te metodologija izrade pouzdanih prediktivnih modela. Napravljena je pilot QSAR studija u okviru koje su izrađeni modeli za predviđanje mehanizma djelovanja kemijskih spojeva koji djeluju kao herbicidi, a molekulska i fizikalno-kemijska svojstva herbicida uspoređena su s onima od registriranih lijekova. U okviru međunarodne inicijative (DREAM challenge) grupa je uključena u modeliranje interakcija kemijskih spojeva sa ciljanom skupinom kinaza.
  • Instalirana je računalna podrška za određivanje taksonomske raznolikosti temeljem analize 16S rRNA amplikona, najnovija verzija QIIME (Quantitative Insights Into Microbial Ecology) programskog paketa. Instaliran je R «vegan» paket za analizu mikrobne raznolikosti i komparaciju rezultata zajedno sa grafičkim sučeljem BiodiversityR. Gore spomenuti računalni paketi testirani na uzorcima sedimenta izuzetog sa različitih lokacija na Jadranskoj obali.

7. Povećanje mjerila

  • Završene su faze istraživanja vezane uz pripremu obnovljivih sirovina odnosno sastavljanje i optimizaciju sastava hranjivih podloga za proces proizvodnje bioaktivnih supstanci (npr. mikrobni lipidi, 5-aminolevulinske kiselina, ß-glukani, probiotici i antibiotici) i biogoriva (bioetanola, biodizela i bioplina).
  • Provedena su istraživanja vezana uz određivanje kinetike rasta odabranih vrsta radnih mikroorganizama i sintezu bioaktivnih supstanci i biogoriva, te razvoj matematičkih modela tih bioprocesa.
  • Testirani su različiti bioreaktorski sustavi (bioreaktori s miješalom, cijevni bioreaktori, air-lift bioreaktori itd.) za proizvodnju bioaktivnih supstanci i biogoriva te su formirani integrirani bioprocesni sustavi koji povezaju bioreaktorski sustav i različite sustave za izdvajanje i pročišćavanje bioaktivnih supstanci i biogoriva.

2. Razlozi za produženje rada na dodatnih pet godina

  • Centar izvrsnosti za Bioprospecting mora BioProCro predstavlja svojevrsnu virtualnu platformu koja po prvi puta ujedinjuje fragmentirane dijelove biotehnologije u Hrvatskoj. Time se omogućuje maksimiziranje operativne iskoristivosti postojeće opreme, stečenog interdisciplinarnog znanja, kompetencije i ljudskih resursa, koji će u konačnici dovesti do podizanja kvalitete istraživanja i primjene rezultata u području biotehnologije. S obzirom na to da biotehnološka industrija prirodnih spojeva predstavlja najbrže rastuće tržište ovaj bi projekt trebao pripomoći da i u Hrvatskoj zauzme  značajno mjesto u rastu gospodarstva.
  • Svaka od 10 projektnih istraživačkih grupa može samostalno funkcionirati (dosadašnji modus operandi), ali objedinjavanjem njihovih rezultata rješava se puno kompleksnija problematika bioprospecting istraživanja, a to omogućuje upravo ovako koncipirana istraživačka platforma.
  • Nabavljena je nova suvremena oprema koja podiže razinu istraživanja, a time i  kompetitivnost naših istraživača na međunarodnoj razini
  • Operativna suradnja partnera u okviru ZCI omogućila je prijavljivanje domaćih i međunarodnih projekata, (prilog 3) i objavljivanje znanstvenih radova u prestižnim časopisima (prilog 2) što je osnova samoodrživosti ZCI-a i nastavka njegovih aktivnosti.
  • Za provedbu zadanih ciljeva u okviru postojećih ili planiranih projekata ili planiranim istraživanjima u budućim projektima nužan je vremenski period koji će osigurati nastavak započetih znanstvenih aktivnosti, održivost primjenjenih tehnoloških i drugih procesa te potencijalnu primjenu ostvarenih rezultata istraživanja u području biotehnologije.
  • U tijeku je obrada izronjenih organizama iz skupine žarnjaka, spužava, mahovnjaka, plaštenjaka, algi (zelene, smeđe, crvene), Do sada dobiveni rezultati pokazuju dobar biotehnološki potencijal izronjenih organizama. Međutim, kako bi sve istraživačke skupine mogle dobiti dovoljne količine uzoraka za daljnju provedbu laboratorijskih analiza, potrebno je izroniti dodatne količine navedenih vrsta.
  • Proširiti će se uzorkovanje na druge vrste koje će zahtijevati razvijanje eksperimentalnih protokola, procesa, uvođanje i modifikaciju analitičkih metoda, razvijanje znanja o načinu djelovanja ciljnih aktivnih molekula.
  • U tijeku je stvaranje repozitorija bioloških uzoraka Jadranskog mora (smrznutih, fiksiranih u etanolu) temeljeno na osiguranju kvalitete uzoraka (sljedivost podataka od uzorkovanja do finalnog ekstrakta); kreiranje zbirke DNA iz odabranih staništa prema filogenetskim kategorijama i biotehnološkom potencijalu.

3. Prijedlozi izmjena u istraživačkom timu, istraživačkom planu, organizacijskoj strukturi i institucionalnoj mreži

  1. Institut Ruđer Bošković:
    • Laboratorij za biotehnologiju u akvakulturi

Dodati u istraživački tim: dr.sc. Lara Čižmek – poslijedoktorand; Denis Vadlja, mag.ing.bioproc. –  doktorand; Maja Galić, mag.ing.bioproc. –  doktorand, Krunoslav Bojanić, dr.med.vet. – poslijedoktorand

    • Laboratorij za strojno učenje i reprezentaciju znanja

Dodati u istraživački tim: Davor Oršolić, mag.ing. molekularne biotehnologije – doktorand; dr.sc. Ozren Jović – poslijedoktorand

    • Laboratorij za stereoselektivnu katalizu i biokatalizu

Dodati u istraživački tim: sc. Irena Dokli, Anđela Buljan, mag. chem.

  1. Kemijsko-tehnološki fakultet u Splitu:
    • Zavod za prehrambenu tehnologiju i biotehnologiju

Dodati u istraživački tim: doc. dr. sc. Zvonimir Marijanović 

  1. Prehrambeno-biotehnološki fakultet u Zagrebu
    • Laboratorij za biokemijsko inženjerstvo, industrijsku mikrobiologiju i tehnologiju slada i piva

Dodati u istraživački tim: Marina Grubiši, mag. ing. bioproc.; Izbrisati iz tima: dr. sc. S. Novak  i prof. dr. sc. P. Horvat zbog odlaska u mirovinu

    • Kabinet za bioinformatiku

Dodati u istraživački tim: Toni Čvrljak, math. – doktorand