Karakterizacija i način djelovanja bioaktivnih spojeva

Voditelji: prof.dr.sc. Krešimir Pavelić and prof.dr.sc. Dražen Vikić-Topić

Ciljevi, ideja i značaj

Okarakterizirati, optimizirati i evaluirati djelovanje biomolekula i biomaterijala izoliranih iz morskih organizama kao sastojaka za razvoj novih proizvoda za dobro definirana ciljna tržišta, osobito potencijalnih nutraceutskih, kozmetičkih, industrijskih i farmaceutskih pripravaka. Karakterizacija kemijski spojevi iz prirodnih izvora izazovna je, osobito segment procjene bioloških mehanizama djelovanja. Tomu je razlog prije svega njihova strukturna složenost i izraženo svojstvo stvaranja interakcija sa čitavom lepezom različitim kemijskih entiteta. Ovo potonje je naročito važno za analizu njihove biološke aktivnosti, često povezane sa potpuno novim i prethodno nepoznatim svojstvima. Danas su u fokusu moderne farma industrije naročito sekundarni metaboliti za koje se očekuje kako će omogućiti proboj u razvoju novih bioaktivnih entiteta Slično tomu, kozmetička industrija i sektor proizvodnje medicinskih pripravaka i dodataka prehrani koji se prodaju bez recpeta, suočeni su sa problemom zasićenja tržišta te su prilike za razvoj inovativnih rješenja i proizvoda sa dodanom vrijednosti velike. Izračunani molekularni i NMR podaci usporedit će se s eksperimentalnim NMR i MS podacima kako bi se dobio dublji uvid u strukturne osobitosti prirodnih spojeva odgovornih za njihovu aktivnost. To će dati bolje procjene fizikalnih i kemijskih svojstava i bioloških aktivnosti ispitivanih prirodnih spojeva. Strukture i konformacije prirodnih spojeva bit će također istražene spektroskopijom NMR, mjereći interakcije NOE, izotopne učinke i učinke kompleksiranja. Dobiveni eksperimentalni i izračunani podaci o strukturi, konformaciji i svojstvima prirodnih spojeva bit će ključni u određivanju njihove biološke važnosti za procese kao što su svijanje proteina, izomerizacija, interakcija liganda i receptora, vezanje vodikovim vezama. kao i za procese u farmakokinetici i dizajnu lijekova. Predložena istraživanja za centar izvrsnosti su interdisciplinarna i multidisciplinarna, te kao takva otvaraju mogućnost kreiranju novih istraživačkih projektnih i programskih prijedloga kao i inovacija, ali i doprinijeti drugim znanstvenim disciplinama.

Znanstvena osnova

Morski organizmi žive u surovom okolišu gdje se trebaju svakodnevno boriti za preživljenje. U njima je stoga raspon vrlo različitih i specifičnih kemikalija koje pokazuju značajne i vrlo raznolike biološke učinke, uključujući antibakterijska i antiproliferativna svojstva, glavno oružje u borbi za opstanak. Primjerice, prvi lijek za liječenje raka dobiven iz mora ‘Cytosar-U’ izoliran je iz karipske morske spužve, te se danas korsiti za liječenje leukemije i limfoma. Nadalje, toksin morskih puževa korišten je za razvoj lijeka ‘Prialt’ za liječenje boli određenih etiologija. U posljednjim godinama, ovo je područje istraživanja zaživjelo te je povećan broj izoliranih novih supstancija iz mora. Neki od tih spojeva imaju zanimljive strukture, iskazuju raspon iznimno korisnih bioloških svojstava i izvrsne su okosnice za razvoj novih spojeva i struktura za razvoj sintetskih terapeutika ili za optimizaciju različitih industrijskih procesa. CNMR grupa objavila je veliki broj Q1 istraživačkih članaka u časopisima s visokim faktorima utjecaja u području eksperimentalnog i teorijskog određivanja bioraspoloživih i bioaktivnih kompleksnih molekula i prirodnih spojeva, a neki od objavljenih radova učestalo su citirani u znanstvenoj literaturi. Uporabom molekulskog modeliranje i NMR I 11 MS spektroskopskih pristupa, karakterizirali smo i istražili veliki broj aktivnih spojeva. Preliminarna biološka ispitivanja pokazala su da nekoliko istraživanih spojeva pokazuje antimikrobne i antitumorske aktivnosti. Stoga, provodi se daljnje dodatno istraživanje ovih spojeva s pomoću QSPR/QSAR modeliranja, i kombiniranog eksperimentalnog rada s pomoću metoda NMR i MS.

Istraživačka kompetencija

Odjel za biotehnologiju sa svojim Centrom za visokoprotočne tehnologije teži poticanju istraživačkih aktivnosti u smjeru tehnološke spremnosti tako što osigurava najbolju infrastruktru i uključuje se u kolaborativne suradnje sa svjetski poznatim i afirmiranim istraživačkim centrima i institucijama za visokoškolsku edukaciju i obrazovanje. Iskustvo djelatnika Odjela i Centra povezano sa ovim projektom uključuje 1.) razvoj eseja i pretklinička evaluacija bioloških učinaka prirodnih i sintetskih spojeva u uvjetima in vitro, 2.) visokoprotočne analitičke metode, 3.) iskustvo u NMR karakterizaciji spojeva, 4.) neuroznanost I 5.) visokoprotočna analitika za industriju. Uključeni znanstvenici imaju više od 6000 citata i objavili su više od 500 znanstvenih radova (WoS). Osoblje Odjela i Centra na čelu sa profesorom Krešimirom Pavelićem i Sandrom Kraljević Pavelić koji će biti uključeni u projekt su priznati stručnjaci u istraživanju raka i pretkliničkoj evaluaciji biološki aktivnih spojeva u Hrvatskoj i svijetu. Aktivnosti na Odjelu i Centru se trenutno financiraju iz 5 nacionalnih projekata, 6 internacionalnih kolaborativnih projekata i 2 projekta koja financira industrija, te projekata koje financira Sveučilište u Rijeci, što sveukupno čini godišnji prihod od 80000 Eura. Slijedeći laboratoriji i Centar će biti dio projekta: 1.) Laboratorij za visokoprotočne analize (voditelj prof. dr. sc. Krešimir Pavelić, doc. dr. sc. Mirela Sedić) specijaliziran za proteomiku i glikomiku, 2.) Laboratorij za sistemsku biomedicine i genomiku (voditelj prof. dr. sc. Sandra Kraljević Pavelić, doc. dr. sc. Elitza Markova Car) specijaliziran za in vitro probir lijekova i mehanističke studije, izolaciju, frakcionaciju i pročišćavanja prirodnih proizvoda, 3.) Centar za visokoprotočne metode (voditelj prof. dr. sc. Sandra Kraljević Pavelić, prof. dr. sc. Djuro Josić, prof. dr. sc. Jasna Peter Katalinić, dr. sc. Uroš Anđelković, doc. dr. sc. Nela Malatesti i doc. dr. sc. Karlo Wittine). U vezi sa predloženim projektom, posebna pažnja i ekspertiza stavljena je na implementaciju visokoprotočnih tehnologija u istraživanja povezana sa biomedicinom i otkrićem lijekova. Članovi tima koji će biti uključeni u inicijativu Centra izvrsnosti imaju međunarodno priznato iskustvo u primjeni genomike i proteomike/glikoproteomike u istraživanju raka i izolaciji/identifikaciji bioaktivnih spojeva iz prirodnih izvora (biljaka i hrane). Konkretnije, tim je specijaliziran u masenoj spektrometriji, analitičkim i preparativnim metodama i in vitro probiru spojeva. Štoviše, iskustvo tima u istraživanju i testiranju terapeutskih spojeva za industriju je dokazano primijenjenim projektima sa industrijskim partnerima. Odjel i Centar imaju opremu neophodnu za izolaciju, analizu i biološka ispitivanja prirodnih spojeva i sastojaka hrane kako slijedi: oprema za staničnu kulturu, oprema za genomiku (RT-PCR, oprema za mikročip analizu, oprema za sekevenciranje DNA), oprema za proteomiku (sistemi za 1-D i 2-D elektroforezu i Western blot), maseni spektrometri (sustavi Q-TOF, QQQ i MALDI-TOF/TOF), funkcijska mikroskopija (konfokalni mikroskop, mikroskopi za elektrokemijske analize, mikroskop atomskih sila), FTIR, oprema za organsku sintezu, NMR uređaji U sklopu predloženog projekta, tima ima za cilj razviti strateški odnos sa centrima izvrsnosti u  hrvatskoj i EU specijaliziranim za izolaciju, karakterizaciju i razvoj prirodnih produkata za medicinske aplikacije sa komplementarnom ekspertizom koji će ubrzati i potpomoći istraživanje novih lijekova ili terapeutskih adjuvansa sa naglaskom na protutumorske spojeve.

Određivanje kemijske strukture i modeliranje prirodnih organskih proizvoda (NPS) provodit će se u Centru za nuklearnu magnetsku rezonancija (CNMR) na Institutu Ruđer Bošković, od strane Dražen Vikić- Topić, voditelja Centra, i suradnika. U CNMR nalazi se oprema od nacionalne važnosti za provođenje NMR istraživanja u širokom rasponu organskih, bioorganskih, biomedicinskih i farmaceutskih spojeva za akademsku zajednicu, ali i za vladine institucije i farmaceutsku industriju. Osim vlastitih znanstvenih i primijenjenih istraživanja, CNMR daje i znanstvenu podršku i usluge, te sudjeluje u prijenosu znanja i obrazovanju na svim razinama. CNMR je interdisciplinarna i multidisciplinarna istraživačka jedinica koja uključuje stručnjake iz kemije, spektroskopije, kemijskih izračuna i modeliranja, kao i iz bioinformatike. Voditelj CNMR i članovi njegove istraživačke grupe imaju dugogodišnje iskustvo u kombiniranom eksperimentalnom i teorijskom određivanje kemijske strukture i dinamike bioorganskih i bioaktivnih spojeva uporabom NMR i MS spektroskopije, kao i UV, VIS i IR spektroskopija zajedno s teorijskim računima na semi-empirijskoj, ab initio, i DFT razini. Taj kombinirani eksperimentalni i teorijski pristup omogućit će predviđanje aktivnih mjesta i pripravu molekula poboljšanih bioaktivnosti. Već dugi niz godina D. Vikić- Topić radi u određivanju struktura farmaceutskih molekula, koje su uključene u istraživanje novog 12 antibiotika azitromicina farmaceutske tvtke Pliva d.d., licencirane od strane tvrtke Pfizer pod imenom Zithromax.

Metode i njihova poveznica sa specifičnim ciljevima

Faza 3. uključivat će određivanje strukture i dinamike prirodnih spojeva, kao i njihove interakcije s drugim spojevima i bioaktivnim fragmenata pomoću metoda NMR i MS (kao što su MALDI-TOF-TOF, ES, itd.). Ostale spektroskopske metode kao što su UV / VIS, IR / Ramanska, koristit će se kako bi se upotpunili podaci i istraživanje. NMR je jedna od najboljih metoda za određivanje kemijske strukture u tekućem stanju, što je vrlo važno za razumijevanje bioaktivnosti prirodnih spojeva u fiziološkim uvjetima. Za određivanje strukture prirodnih spojeva koristit će se različite jedno- i dvo-dimenzionalne te homo- i hetero-nuklearne NMR metode kao što su COSY, TOCSY, NOESY, ROESY, HMQC, HMBC i DOSY. Bude li potrebno, strukture će se izotopno označiti kako bi se olakšalo određivanje strukture. Ova NMR istraživanja bit će dopunjena s molekularno-mehaničkim, kvantno-kemijskim i diskretno-matematičkim izračunima, jer su odnosi struktura i aktivnosti od presudne važnosti. Izračunat će se molekularni strukturni deskriptori koji će se primjenjivati u razvoju QSPR / QSAR modela od strane Bone Lučića, člana CNMR. Izračunani molekularni i NMR podaci usporedit će se s eksperimentalnim NMR i MS podacima kako bi se dobio dublji uvid u strukturne osobitosti prirodnih spojeva odgovornih za njihovu aktivnost. To će dati bolje procjene fizikalnih i kemijskih svojstava i bioloških aktivnosti ispitivanih prirodnih spojeva. Strukture i konformacije prirodnih spojeva bit će također istražene spektroskopijom NMR, mjereći interakcije NOE, izotopne učinke i učinke kompleksiranja.

 Očekivani ishodi i njihovi potencijalni korisnici

Intelektualno vlasništvo, povećan broj znanstvenih radova, povećana vidljivost internacionalizacija. Prototip: proizvodi s dodanom vrijednosti (farmaceutska, prehrambena, kozmetička industrija). Karakterizacija biološki aktivnih spojeva (analize NMR, UPLC-MS/MS, MALDI-TOF MS/MS, FTIR). Ovaj je korak neophodan u rasvjetljavanju novih struktura i evaluaciji potencijalnih farmakoloških učinaka. Ineterna radionica za procjenu rezultata dobivenih unutar aktivnosti. Diskusija i odlučivanje o tome koji će spojevi biti izabrani za detaljne biološke evaluacije. Biološka evaluacija in vitro. In vitro probir protutumorskih i protuviralnih učinaka, ciljana analiza drugih bioloških učinaka (inhibicija enzima, antibakterijski učinci). Procjena toksikoloških parametara in vitro i in vivo (testovi na fibroblastima, Komet esej, in vivo toksikologija na štakorima i modelima beskralježnjaka). Detaljna analiza bioloških učinaka visokoprotočnim metodama genomike i transkriptomike (analiza učinaka spojeva na transkriptom, protoemske analize). Interna radionica za procjenu rezultata dobivenih u sklopu aktivnosti. Diskusija i odlučivanje o tome koji će spojevi biti izabrani za razvoj sirovina/formulacija koji se mogu koristiti u industrijskom sektoru. Organizacija tečajeva edukacije (praktični tečajevi i specijalizirane radionice) za akademiju i profesionalce.